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La presente invención puede utilizarse adicionalmente en la valoración de anomalías pre-malignas de las células prostata marker erhöht glandulares del cérvix neoplasia intra-epitelial perdiendo peso, GIN o anomalías pre-malignas en otros tejidos. Las muestras pueden incluir procesos cancerosos de células glandulares p. Dichos anticuerpos pueden aplicarse a las muestras de biopsias de mama o de aspiración con aguja fina FNA o a las muestras de fluido de los ductos glandulares mamarios, lo que permite su utilización en programas de cribado.

Las reactividades de un miembro de unión como un anticuerpo en las muestras normales y prostata marker erhöht ensayo pueden determinarse mediante procedimientos adecuados conocidos.

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Una posibilidad es el marcaje individual con moléculas reporteras. Dichas moléculas reporteras pueden generar señales de forma directa o indirecta y preferentemente de forma cuantificable.

La unión de las prostata marker erhöht reporteras puede ser directa o indirecta, p.

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La unión prostata marker erhöht un enlace peptídico puede ser el resultado de la expresión recombinante de prostata marker erhöht fusión génica que codifique la molécula de unión p.

Los fluorocromos adecuados incluyen la fluoresceína, la rodamina, la ficoeritrina y el Texa Red. Los colorantes cromogénicos adecuados incluyen la diaminobenzidina. Estas moléculas pueden ser enzimas que catalicen reacciones que desarrollan o cambian la coloración o causan cambios en las prostata marker erhöht eléctricas, por ejemplo. Pueden ser moléculas excitables, como las transiciones electrónicas entre los estados de energía que dan como resultado absorciones o emisiones espectrales características.

Pueden incluir entidades químicas utilizadas junto con biosensores. El modo de determinación de la unión no es una característica de la presente invención y los expertos en la materia son los capacitados para elegir el modo adecuado de acuerdo con su preferencia y conocimiento general.

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Se han realizado otros experimentos con la fosfatasa alcalina, con resultados similares por ejemplo con frotis cervicales. Un protocolo para la tinción con anticuerpos de frotis cervicales, que prostata marker erhöht ha utilizado en las realizaciones de la presente invención es el siguiente:.

Fijar los frotis frescos durante 5 minutos en acetona:metanol a Si un frotis se ha cubierto con cualquier otra capa prostata marker erhöht, se puede utilizar cualquier otro tratamiento adecuado para exponer una muestra a la tinción con el anticuerpo.

Colocar los portaobjetos en solución de hematoxilina de Harris durante 6 segundos. Los frotis para la inmunofluorescencia pueden prepararse de forma prostata marker erhöht y así se ha realizado. Los procedimientos de producción de anticuerpos incluyen la inmunización de un mamífero p. También es posible la inmunización con el DNA que codifica el polipéptido diana.

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prostata marker erhöht Los anticuerpos pueden obtenerse de animales inmunizados utilizando una de las muchas técnicas conocidas en la materia y cribarse, preferentemente utilizando la unión del anticuerpo a un antígeno de interés.

Por ejemplo, pueden utilizarse las técnicas de transferencia de Western o las de inmunoprecipitación Armitage y col. Los anticuerpos monoclonales pueden someterse a las técnicas de tecnología del DNA recombinante para producir otros anticuerpos o moléculas quiméricas que retengan prostata marker erhöht especificidad del anticuerpo original.

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Un hibridoma productor de un prostata marker erhöht monoclonal puede someterse a una mutación genética u otros cambios, que pueden alterar o no la especificidad de unión de los anticuerpos produci- dos. Prostata marker erhöht una alternativa o complemento a la inmunización de un mamífero con un péptido, se puede obtener un anticuerpo específico para una diana a partir de una librería recombinante de expresión de dominios variables de inmunoglobulinas, p.

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La librería puede ser nativa, es decir construida prostata marker erhöht partir de secuencias obtenidas de un organismo que no ha sido inmunizado con la diana o puede construirse utilizando secuencias obtenidas de un organismo que ha sido expuesto a un antígeno de interés o un fragmento de lo mismo. Los anticuerpos pueden modificarse de muy diversas maneras. Incluso, salvo que el contexto indique lo contrario, el término "anticuerpo" podría considerarse como el que incluye cualquier sustancia de unión específica prostata marker erhöht tenga un dominio de unión antígeno-anticuerpo.

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Por ello, dicho término abarca los fragmentos, los derivados y las funciones equivalentes de un anticuerpo, incluyendo cualquier polipéptido que comprenda un dominio de unión a inmunoglobulina, bien sea natural o sintético.

Prostata marker erhöht consecuencia, también se incluyen las moléculas quiméricas que comprenden un dominio de unión a inmunoglobulina, o equivalente, fusionado a operacion prostata consecuencias polipéptido. El clonaje y la expresión de anticuerpos quiméricos se describen en las patentes europeas EP-A y EP-A Se ha demostrado que la función de los antígenos de unión puede realizarse por los fragmentos de un anticuerpo completo.

Holliger y col. USA 90 La expresión recombinante de los prostata marker erhöht, incluyendo los anticuerpos y los fragmentos de anticuerpos, es bien conocida en la materia. Asimismo, son bien conocidos los sistemas para el clonaje y la expresión de un polipéptido en una variedad de células huésped. Las células huésped adecuadas incluyen las bacterias, las células de mamífero, las levaduras prostata marker erhöht los sistemas de baculovirus.

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Los huéspedes preferidos para la expresión prostata marker erhöht baculovirus son las células de insectos como la línea celular SF9.

Los vectores adecuados pueden elegirse o construirse de forma que contengan secuencias reguladoras adecuadas, incluyendo las secuencias prostata marker erhöht, los fragmentos terminadores, las secuencias de poliadenilación, las secuencias intensificadoras de la transcripción, los genes marcadores y otras secuencias adecuadas. Los procedimientos de transformación dependen del huésped utilizado, siendo en general bien conocidos en la materia.

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Se puede utilizar una molécula de unión específica para detectar la diana en un fluido corporal, p. La progresión y la prostata marker erhöht tumoral pueden monitorizarse, por ejemplo, en respuesta al tratamiento o en la recaída.

Por ello y de acuerdo con la presente invención, es posible valorar una muestra de sangre o de otro fluido corporal, p.

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Se generaron los anticuerpos y se purificaron por afinidad, tal como se describió por Romanowski y col. USA, prostata marker erhöht, Tres anticuerpos reconocieron una banda predominante de 62 Prostata marker erhöht en los extractos totales y en los extractos nucleares de células HeLa.

La proteína se expresó en células E. Los anticuerpos se generaron tal como se prostata marker erhöht por Romanowski y col. Anteriormente se había demostrado por transferencia de Western que la línea celular humana inmortal HeLa expresaba Cdc6 y MCM5 durante el ciclo celular Williams y col. USA,; Schulte y col. Recientemente, se ha publicado la regulación negativa de Cdc6 en fibroblastos humanos Wi38 por Williams y col.

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prostata marker erhöht El crecimiento de la línea celular NIH 3T3 se paró al llegar a la confluencia. Los prostata marker erhöht se mantuvieron en la quiescencia durante 7 días. Las células se liberaron del paro en G0 mediante tripsinización y nueva siembra en placas. Los extractos proteicos soluble sobrenadante y nuclear sedimento se prepararon en intervalos de tres horas, se realizó una inmunotransferencia con los extractos utilizando anticuerpos contra MCM5, Orc2 y Cdc6 humanas.

La Orc2 véase Gavin y col.

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También se obtuvieron resultados similares con la línea EJ13 humana derivada de un carcinoma de vejiga. Estos prostata marker erhöht indican que la ausencia de Cdc6 en las células quiescentes es un fenómeno general.

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Estos estudios se ampliaron mediante inmunofluorescencia y aplicación de anticuerpos anti-Cdc6 y anti-MCM5 a las células enteras. La expresión de Cdc6 y MCM5 también se halló que se regulaba negativamente cuando los fibroblastos humanos de recién nacido NHF eran inducidos a la quiescencia por inhibición por contacto. Los NHF crecieron hasta la confluencia y se mantuvieron en ella durante 3 días. A continuación, se liberaron las células de la fase G0 mediante tripsinización y sembrado en nuevas placas.

Se recolectaron las células enteras a diversos tiempos después del paso de G0 hasta su entrada en la fase S. La tinción con yoduro de propidio se prostata marker erhöht para teñir el DNA y los prostata marker erhöht se compararon con la tinción de las muestras con anticuerpos anti-Cdc6 y anti-MCM5.

Las células quiescentes G0 no mostraron inmunoreactividad para Cdc6, pero sí una señal muy débil con el anticuerpo anti-MCM5. prostata marker erhöht

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Sin embargo, durante la entrada en el ciclo celular y la fase S, se observó inmunoreactividad nuclear fuerte para Cdc6 y MCM5. Estos estudios pueden sugerir que los anticuerpos anti-Cdc6 podrían proporcionar un marcador para las células proliferantes similar a PCNA o Ki Los resultados descritos en el Ejemplo 2 sugieren prostata marker erhöht la expresión de Cdc6 puede parecerse a la de PCNA o Ki67, no habiendo sido satisfactoria ninguna de ellas para prostata marker erhöht citología cervical.

Los presentes inventores compararon prostata marker erhöht anticuerpos contra estas proteínas en secciones de cérvix uterino normal o afecto.

En cérvix normal, los anticuerpos contra los cuatro antígenos mostraron inmunotinción positiva de las células epiteliales confinada a las capas basales y parabasales.

La reacción se paró mediante lavado con agua corriente. A continuación, los portaobjetos se prostata marker erhöht ligeramente con hematoxilina de Gill, se deshidrataron mediante gradientes de etanol y se lavaron dos veces durante 6 minutos con xilol.

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A priori se debería esperar que Cdc6 y MCM proporcionaran resultados similares a Ki67 y PCNA, ya que todas estas proteínas pueden considerarse "marcadores de proliferación".

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Dichas muestras, de interés primordial para propósitos de cribado, no son suficientemente robustas para ser sometidas a un tratamiento por calor en una olla a presión. Ello indica su utilidad prostata marker erhöht la valoración de muestras de frotis tomadas a partir de la superficie del epitelio cervical, habiéndose verificado experimentalmente en la presente invención.

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El carcinoma cervical puede ser prevenido mediante cribado poblacionl, ya que evoluciona desde estadios "intraepiteliales" no invasivos y bien definidos Wright, y col.

Kurgan, Editor.

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Las anomalies intraepiteliales escamosas pueden clasificarse utilizando los sistemas de valoración Bethesda que diferencian en 2 o 3 grados de malignidad CIN. Anomalías histológicas distintas se correlacionan ampliamente con el tipo de infección HPV y con prostata marker erhöht ploidía del DNA, la clonalidad y la historia natural de la lesión.

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De modo similar, aunque los patólogos puedan entrenarse para interpretar secciones histológicas, requieren una formación adicional especializada en citopatología para poseer competencias técnicas adecuadas y para organizar prostata marker erhöht supervisar el laboratorio citológico y asimismo para realizar diagnósticos adecuados de los frotis anormales.

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Existen problemas de sensibilidad prostata marker erhöht de valores de predicción positivos utilizando los procedimientos in situ para HPV. La segunda propuesta implica la automatización. La valoración previa de marcadores de proliferación celular prostata marker erhöht ha proporcionado ninguna solución por el momento, por lo que los expertos en el campo son escépticos de que dichos marcadores de proliferación proporcionen información clínica de utilidad Hall y Coates, Histopathology, Los intentos para utilizar la tinción inmunocitoquímica o inmunofluorescente con el cribado cervical automatizado se han visto limitados por la tinción inespecífica de las células normales.

En consecuencia, aunque la tecnología para cuantificar prostata marker erhöht tinción inmunohistológica esté disponible, ninguno de los cribados automatizados que se hallan en el mercado o en desarrollo avanzado utiliza la inmunohistoquímica por el momento.

Los inventores de la presente invención han estudiado las prostata marker erhöht implicadas en el estadio de iniciación temprana de la replicación del DNA. Williams y col. USA,publicaron que las células HeLa en cultivo expresan Cdc6 en los ciclos de proliferación celulares, pero que los fibroblastos humanos diploides W prostata marker erhöht la expresión de Cdc6 tras entrar en quiescencia al ser retirado el suero del medio de crecimiento.

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Se ha demostrado aquí, que estas observaciones se pueden ampliar a otras líneas celulares y otras especies. Evidencias adicionales de ello provienen de Hiraiwa y col. Sorprendentemente, sin embargo, los presentes prostata marker erhöht han observado diferencias importantes en el valor diagnóstico potencial de las MCMs y Cdc6 en comparación con PCNA y Ki Los inventores han analizado antisueros dirigidos contra las proteínas humanas MCM y Cdc6 para prostata marker erhöht cervical.

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Han estudiado secciones del cuello uterino y frotis cervicales. Los anticuerpos contra Cdc6 o contra MCM p. En las muestras cervicales sometidas a la recuperación antigénica tratamiento prostata marker erhöht calor con la olla a presión o autoclavehabiendo sido dichas muestras fijadas en formalina y embebidas en parafina, los anticuerpos anti-Cdc6 y anti-MCM proporcionan patrones similares de tinción a los obtenidos con PCNA, pero resultados claramente superiores con frotis, muestras frescas y congeladas.

Por ello, la presente invención hace referencia por lo general a diversos aspectos relacionados con procedimientos y medios para detectar La buena dieta polipéptido diana particular, o un mRNA que codifique un polipéptido diana, en un tejido, fluido o células de un individuo, generalmente a partir de una muestra corporal del individuo.

Los polipéptidos diana de la presente invención como las proteínas Cdc6 y MCM, como la MCM5, incluidas dentro del complejo de preiniciación de la replicación del DNA, pueden diferenciarse de otros marcadores de proliferación celular prostata marker erhöht no sean de utilidad porque son desplazados de la cromatina durante la prostata marker erhöht y la diferenciación celular. La proteína ORC2 Gavin y coll.

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Cdc6 pronto se regula negativamente durante la quiescencia y diferenciación celular. Las células cultivadas paradas en G0 durante un tiempo tan corto como 48 horas no contienen ninguna proteína Cdc6 detectable. Cdc6 no es detectable en las células paradas in vitro durante prostata marker erhöht mayores de tiempo o en células diferenciadas ex vivo.

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Las células paradas in vitro mediante deprivación de suero o inhibición por contacto pierden las MCMs unidas a cromatina al cabo de pocos díasaunque el nivel total de MCMs prostata marker erhöht las células no disminuye de forma prostata marker erhöht, al menos durante 14 días.

Las células que llevan a cabo la diferenciación in vitro p. Los ejemplos incluyen los componentes humanos homólogos de levaduras, como la proteína quinasa Cdc7 Chapman y Johnston, Exp.

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Cell Res. Cell Biol. Los polipéptidos diana de la presente invención pueden considerarse como componentes del complejo pre-replicativo del DNA, componentes de la cromatina prostata marker erhöht de replicación implicados en la restricción de la replicación del DNA a una vez por cada ciclo celular, como componentes de la conformidad para la replicación, implicados en dar el visto bueno prostata marker erhöht la cromatina para una solo ciclo de replicación de DNA y reunidos en los orígenes de la replicación antes de la iniciación de la replicación del DNA.

La secuencia aminoacídica de Cdc6 se describe en Williams y col. La secuencia MCM2 humana se describe en Todorov y col. Cell Sci.

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La secuencia MCM3 humana se describe en Thommes y col. La secuencia MCM4 humana se describe en Ishimi y col.

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La secuencia MCM5 humana se describe en Hu y col. La secuencia MCM6 humana se describe en Holthoff y col.

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La secuencia MCM7 humana se describe en Hu y col. De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento de determinación de la presencia o ausencia de células de proliferación prostata marker erhöht o prostata marker erhöht anomalía del crecimiento celular en una muestra de prostata marker erhöht individuo. Dicho procedimiento incluye el contacto de una muestra con un miembro de unión específica dirigida contra un polipéptido diana, tal como se describe, y la determinación de la unión del miembro de unión específica con la muestra.

La Cdc6 humana ha sido clonada independientemente por los presentes inventores, tal como se describe aquí, pero la primera prostata marker erhöht de su clonaje corresponde a Williams y col. Tal como se demostró experimentalmente aquí, las moléculas de unión anti-Cdc6 son muy eficaces para el marcaje de anomalías del crecimiento en diversos tejidos, especialmente en muestras cervicales, preferentemente de frotis.

Prostata marker erhöht se compara con la falta de unión con el tejido cervical normal en una muestra de frotis. La evidencia experimental incluida aquí muestra que las moléculas de unión dirigidas contra MCM5, al igual que para Cdc6, son muy eficaces para el marcaje de anomalías en tejidos diversos, especialmente en muestras cervicales, preferentemente de frotis. Se ha hallado que La buena dieta anticuerpos anti-CD6 proporcionan un patrón de tinción similar al de anti-MCM5.

Por ello se procede a realizar un cribado a los seis meses para seguir el progreso o la regresión de la displasia y permitir la intervención terapéutica adecuada y en el momento apropiado si fuera necesario. Se ha de remarcar prostata marker erhöht la invención no se limita a la detección de la anomalía de crecimiento celular que es necesariamente pre-cancerosa o cancerosa.

Por ello, un frotis cervical, por ejemplo, puede analizarse con la prueba de frotis Pap y con una prueba de acuerdo con la presente invención.

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Otro aspecto de la presente invención proporciona un procedimiento de marcaje de células anómalas dentro de una muestra de tejido. El procedimiento incluye el contacto de la muestra con un miembro de unión específica dirigido contra un polipéptido diana, como Cdc6, MCM5 u otra MCM tal como se indicó anteriormente, en condiciones prostata marker erhöht que el miembro de unión específica se une a las células con una proliferación anómala y no a las que presentan una proliferación normal.

Es posible determinar si un miembro de unión específica se une o no Dietas rapidas la muestra con el fin de establecer la presencia de células de proliferación anómala dentro de la muestra.

Por ello, la presente invención hace referencia a la utilización de un miembro de unión específico prostata marker erhöht contra un polipéptido diana, tal como se indicó anteriormente, para determinar, establecer o diagnosticar la presencia o ausencia de una proliferación celular anómala, crecimiento celular anómalo, displasia, neoplasia, o un estado potencial o realmente pre-canceroso o canceroso en una muestra de prostata marker erhöht.

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Los reactivos pueden proporcionarse dentro de recipientes que los protejan del entorno externo, como por ejemplo un prostata marker erhöht sellado. Para validar la actividad y la utilización correcta de los reactivos utilizados de acuerdo prostata marker erhöht la invención, pueden utilizarse controles positivos y negativos, los cuales pueden proporcionarse en un equipo.

Las muestras pueden obtenerse del cuerpo del individuo utilizando cualquier medio y técnica convencional.

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También se puede obtener una muestra de un medio líquido en lugar de realizar un frotis y extender las células sobre un portaobjetos. Se pueden obtener muestras de sangre o de otro fluido corporal utilizando una prostata marker erhöht o una aguja.

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Otros tipos de muestras se pueden obtener mediante biopsia o corte del prostata marker erhöht. Hiraiwa y col. Tal como se discutió anteriormente, en una realización preferida la muestra es un frotis cervical.

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Los frotis cervicales no son lo suficientemente robustos para ser sometidos prostata marker erhöht tratamiento al calor por ejemplo en una olla a presión. La presente invención puede utilizarse adicionalmente en la valoración de anomalías pre-malignas de las prostata marker erhöht epiteliales glandulares del cérvix neoplasia intra-epitelial glandular, GIN o anomalías pre-malignas en otros tejidos.

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Las muestras pueden incluir procesos cancerosos de células glandulares p. Dichos anticuerpos pueden aplicarse a las muestras de biopsias de mama prostata marker erhöht de aspiración con aguja fina FNA o a las muestras de fluido de los ductos glandulares mamarios, lo que permite su utilización en programas prostata marker erhöht cribado. Las reactividades de un miembro de unión como un anticuerpo en las muestras normales y a ensayo pueden determinarse mediante procedimientos adecuados conocidos.

Una posibilidad es el marcaje individual con moléculas reporteras.

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Dichas moléculas reporteras pueden generar señales de forma directa o indirecta y preferentemente de forma cuantificable. La unión de las moléculas reporteras puede ser directa o indirecta, p.

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La unión mediante un enlace peptídico puede ser prostata marker erhöht resultado de la expresión recombinante de una fusión génica que codifique la molécula de unión p.

Los fluorocromos adecuados incluyen la fluoresceína, la rodamina, la ficoeritrina y el Texa Red.

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Los colorantes cromogénicos adecuados incluyen la diaminobenzidina. Estas moléculas pueden ser enzimas que catalicen reacciones que prostata marker erhöht o cambian la coloración o causan cambios en las propiedades eléctricas, por ejemplo.

Pueden ser moléculas excitables, como las transiciones electrónicas entre los estados de energía que dan como resultado absorciones o emisiones espectrales características. Pueden incluir entidades químicas utilizadas prostata marker erhöht con biosensores.

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El modo de determinación de la unión prostata marker erhöht es una característica de la presente invención y los expertos en la materia son los capacitados para elegir el modo adecuado de acuerdo con su preferencia y conocimiento general. Se han prostata marker erhöht otros experimentos con la fosfatasa alcalina, con resultados similares por ejemplo con frotis cervicales.

Un protocolo para la tinción con anticuerpos de frotis cervicales, que se ha utilizado en las realizaciones de la presente invención es el siguiente:.

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